1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
{title}1.前言环境DNA是指直接从环境样品（土壤、沉积物、水等）中获得的遗传物质[1]。
环境DNA来自物种与环境的相互作用，从而实现将DNA不断地排放入环境中。
环境中的DNA主要是以胞内和胞外两种形式存在，而胞外DNA可以游离在水中或者附着于介质[2]。
在很多环境中胞外游离DNA的浓度不低于甚至高于胞内DNA。
如Mao等人研究发现，河流沉积物中胞外DNA的浓度高于胞内DNA[3]。
Yuan等人同样研究发现，城市污水出水中胞外DNA的浓度远高于胞内DNA，最高可达10倍以上[4]。
胞外DNA主要是由死细胞累裂解产生或者活细胞主动分泌[5]，具有丰富的遗传信息，能够在环境中长期存在，对生物的生长进化具有重要的作用[6-7]。
本文主要综述常用的几种胞外DNA提取方法以及磁珠法提取DNA的研究进展。
2.胞外DNA的提取方法目前，提取核酸的方法主要有两种：一种是利用有机溶剂的液相方法，另外一种是固相提取法，已经广泛应用DNA分离、提取以及纯化[8]。
液相提取法中常用的胞外DNA提取方法主要有乙醇沉淀法、CTAB (cetyltri -methylammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵)法等。
乙醇沉淀法主要是利用乙醇洗去核酸表面的水化层，使核酸中带负电磷酸基团暴露出来，然后利用水中带正电的离子在静电力作用下吸附下沉[9]，对于低于20个碱基对DNA效率低[10]。
CTAB法依据十六烷基三甲基溴化铵作为一种阳离子物质，从低离子溶液浓度中沉淀核酸[11]。
这两种方法在提取DNA的过程中都未与DNA形成特异性结合，且都需限制在一定浓度盐条件下。
乙醇沉淀法、CTAB法以及DNA提取试剂盒大多数用于沉积物（土壤或者污泥）中DNA的提取[12]。
而且这些方法复杂且劳,适用于环境中富含胞外DNA的样品，对于低浓度的DNA或者以游离DNA为主水样样品的提取效果并不是会很理想[13-14]。
此外，污水水质条件复杂多样，其水体中存在大量的负离子，利用静电吸附作用会使得提取的DNA不纯。
固相提取法常用的固体二氧化硅及其衍生物、磁珠、聚合物等。
二氧化硅及其衍生物主要利用硅与DNA能较好地结合，同时二氧化硅能够提供较大的比面积[8]。
磁珠法通过可逆的结合核酸，在外加磁场作用进行分离，提取效率高，减少离心等其他作用对DNA的破坏。
Yuan等人利用磁珠法对污水中游离DNA的提取效率能够达到83.5%以上，但对于环境中低浓度的游离DNA提取仍存在问题[3]。
3.磁珠法提取DNA研究进展磁珠法提取DNA主要依靠磁珠的性能。
Fe3O4纳米粒子具有强磁性、高比表面积以及优异生物容性和易表面修饰性[15]，但在酸性条件下具有不稳定性以及在空气中易氧化聚集[16]等问题。
所以，在磁珠表面进行聚合层修饰提高磁珠性能已经主要的研究方向。
磁珠表面负载二氧化硅聚合层是常用一种方式。
DNA主链上的磷酸二酯是强酸，在大多数的pH条件下，每个碱基对带有两个负价电荷[8]。
在磁珠表面负载二氧化硅聚合层，主要依靠硅与DNA上磷酸基团形成氢键结合[8]。
但硅醇为弱酸[8]，在碱性或者接近中性的环境中，所带电荷为负电，会受静电斥力的影响；因此，同样需要在高盐环境下进行。
例如Sheng等人制备一种介孔状二氧化硅磁珠对DNA结合能力好，但制备方法比较难[17]。
多巴胺，是人体分泌一种物质，具有良好地生物溶性[18]。
聚多巴胺（PDA）带有氨基，在碱性的条件下会自行聚合，聚合过程中具有共价和非共价作用（螯合、氢键和范德华力），易在磁珠表面生成涂层[19]。
磁珠表面带有氨基，氨基带正电，而环境中DNA主要带负电，在静电吸附作用下使得DNA被吸附[20]。
此种方法目前还未应用环境中DNA的提取，然而环境中物质复杂，会对DNA结合产生污染或者冲击。
羟基或者羧基等官能团，易于DNA上的磷酸基团形成氢键，从而对DNA形成特异性吸附。
磁珠法提取环境中的DNA依旧是需要在高浓度盐的体系下进行，从而使得提取条件受到限制。
除此之外，不同的DNA结合缓冲液也会对磁珠法提取DNA产生影响。
Rohland等人提出一种新的DNA结合缓冲溶液，提高对短链DNA的结合效果，对于环境中游离DNA提取具有参考意义[21]。
4.前景与展望磁珠法提取环境中DNA是一种相对具有发展潜力的方法。
如何制备一种高提取率、耐环境影响的磁珠是我们所需要首先考虑的。
磁珠法主要是依靠磁珠表面的聚合层对DNA起主要吸附作用。
如何寻找一种DNA吸附效果好且环境适应能力强是我们目前做需要做出突破的。
其次，除了上述研究中所阐述的DNA吸附机理外，还可从利用化学物质吸附碱基的方向去考虑，从而提高对DNA特异性吸附。
此外，目前常用的DNA提取方法主要针对血液中DNA提取，对于复杂多样的环境中DNA的方法相对较少。
本课题依托水质科学与技术的专业平台展开研究，以期提出一种新的污水中胞外游离DNA提取方法。
参考文献[1]Thomsen P F , Willerslev E . Environmental DNA An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity[J]. Biological Conservation, 2015, 183:4-18.[2]Zhang Y, Li A, Dai T, et al. Cell-free DNA: a neglected source for antibiotic resistance genes spreading from WWTPs [J]. Environmental science 667[6]Pote J , Mavingui P , Navarro E , et al. Extracellular plant DNA in Geneva groundwater and traditional artesian drinking water fountains[J]. Chemosphere, 2009, 75(4):498-504.[7]Matthew, A, Barnes, et al. Environmental Conditions Influence eDNA Persistence in Aquatic Systems[J]. Environmental Science lez, Cabrera V M . Improved ethanol precipitation of DNA[J]. Electrophoresis, 2010, 31(8):1350-1352.[11]Ze-Yu F U , Jian-Cheng S , Jameson P E , et al. A rapid and cost effective protocol for plant genomic DNA isolation using regenerated silica columns in combination with CTAB extraction[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2017.[12]Corinaldesi C , Danovaro R , Dell"Anno A . Simultaneous Recovery of Extracellular and Intracellular DNA Suitable for Molecular Studies from Marine Sediments[J]. Applied 4H2O（4.30 g）和FeCl36H2O（11.68 g）在N2气氛下成功地完全溶解在200 mL去离子水中，并在85℃快速混合。
然后将25mL的NH4OH水溶液（25％）缓慢加入到容器中，溶液颜色迅速变为黑色（从铁盐溶液的橙色），收集得到的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水洗涤三次，再用100 mL氯化钠（0.02 molL-1）洗涤一次，并分散在去离子水中以备后用。
2.1.2二氧化硅磁珠包裹的磁珠制备将制备的磁铁矿（25 mL）置于容器中，并通过外部磁体沉降。
除去上清液后，加入80mLTEOS水溶液（10％v / v），然后加入60 mL甘油，并使用冰醋酸将混合物的pH降低至4.6。
然后，将悬浮液在90C的氮气氛下加热并机械搅拌2小时。
反应完成后，将产物在室温冷却，并通过施加外部磁场分离获得的材料。
最后，将二氧化硅涂覆的磁性纳米颗粒用去离子水（500 mL）和乙醇（500 mL）洗涤数次，并分散在去离子水中以进一步使用。
2.1.3介孔状二氧化硅磁珠制备将1 g二氧化硅包覆的Fe3O4纳米颗粒分散在400mL乙醇，140mL去离子水和0.1 g CTAB的混合物中，通过在室温下超声搅拌30分钟进行溶解。
然后，将20mL TEOS滴加到溶液中，并将得到的混合物在80℃下连续搅拌12h。
，利用磁体收集产物，并且用蒸馏水和乙醇洗涤几次。
接着将获得的样品再分散在200 mL硝酸铵的乙醇溶液（0.6％，W / V）中，并在80℃下回流24小时，删除CTAB模板。
最后用磁体收集所得的产物，反复用蒸馏水和乙醇洗涤，并真空干燥。
2.1.4羟基修饰的介孔状二氧化硅磁珠制备将5.00mL的介孔状二氧化硅磁珠分散到烧瓶中的甲苯（50.00mL）中，然后在连续搅拌下将AAPTS（5.00mL）逐渐添加到溶液中,制得氨基化的磁珠。
将6.50 g一氯乙酸溶于10.00mL水中，并且在0℃搅拌的同时，向该溶液中滴加3.15 g氢氧化钠在10.00mL水中的溶液，以将pH值调节至8.0。
将5.50g氨基化的磁珠分散在烧瓶中的乙醇（150.0mL）中，然后逐渐加入上述溶液，在连续搅拌下将混合物回流10小时，并在反应过程中加入碳酸钠溶液将混合物的pH值调节至9.0-10.0。
最后，将反应内容物过滤并用双蒸水洗涤几次至中性，然后在70℃下真空干燥12小时。
2.2 DNA的提取方法首先将3mL异丙醇和4mL的CL buffer(蛋白酶K，在30mM Tris-CL中20 gL-1，天根生物科技公司，中国）添加到5 mL的样品滤液中，并充分混合以去除杂质，再加入30 L的磁珠备用液，颠倒混匀，在快速核酸提取仪涡旋震荡4分钟后，将混合物置于磁力架上以沉淀磁珠并弃去上清液。
然后用1 mL的Buffer CW1(2M盐酸胍，70％（体积/体积）的2-丙醇和0.05％（体积/体积）的Tween 200）洗涤磁珠，再次利用磁力架除去上清液。
接着用Buffer CW2(75%的乙醇）洗涤两次，在室温下放置10～15min使残余的乙醇充分挥发。
将30L的Elution Buffer(pH8.5 ，10mM Tris-HCl，预热至55℃）添加至磁珠中震荡，每个20s振满5min。
最后将混合物置于磁力架上收集上清液用于DNA分析。
将获得的DNA采用Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳验证。
2.3优化磁珠的提取方法为了优化样品定量，将不同体积（1、2、5、10或40 mL）样品用于eDNA提取，对于所有样品剂量测试，添加的磁珠储备液（50g/L）的体积为20μL。
为了确定磁珠剂量的影响，使用5、10、15和20μL磁珠储备液（每毫升样品）提取eDNA，同时将样品体积保持在2mL。
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