1. 研究目的与意义
一、文献综述 1. 为了探索观察到的功能变化( 改变特异性 ,提高分子氧亲和力 )的结构基础,对PA - LOX的Ala420Gly突变体在1.8μA分辨率下的晶体结构进行了解析,并与野生型酶进行了比较。对催化中心脂肪酸比对的建模认为,在野生型酶中双氧是通过一个蛋白质隧道将催化中心与蛋白质表面连接起来的花生四烯酸的C15定向。Ala420Gly交换通过分叉这一通道重定向酶内O2的扩散,使花生四烯酸的C11也可以进入O2的插入 为了检验该概念对PA- LOX的适用性,并探讨可能发生特异性改变的结构基础,对PA- LOX的Ala420Gly突变体进行了表达和纯化,并在1.8μA分辨率下求解了其晶体结构。比较野生型和突变型PA- LOX的3D-结构发现,Ala420Gly取代诱导2倍的分子氧亲和力提高,花生四烯酸转化为几乎等量的15S-和11R-HETE具有双重反应特异性。酶-底物复合物的结构模型表明,Ala420Gly交换分叉了推测的O2通道,使除15S-HETE形成外,11R-脂氧化成为可能 对于野生型PA - LOX及其Ala420Gly取代变体,催化循环的第一基本反应(氢提取)是相同的。因此,Ala420Gly突变体不同的反应特异性可能与后续O2插入的立体化学改变有关。与野生型酶相比,Ala420Gly突变体具有更高的分子氧亲和力. 相对于哺乳动物LOX,对于其双氧Km-值在5 ~ 40μM之间变化的研究早有报道,野生型PA-LOX ( KmO2为406μM )表现出相当低的分子氧亲和力。这样的动力学性质对于传感器蛋白来说是有特点的。Ala420Gl的交换几乎使分子氧亲和力提高了一倍( Ala420Gly突变体的Km值为235μM,野生型的Km值为406μM )。两种酶的催化效率( kcat / Km )几乎不被Ala420Gly交换所改变。 将野生型PA- LOX的蛋白表面与催化中心相连,这个隧道系统可能构成一个允许蛋白质内O2扩散的分子氧传递隧道,大约50 %的隧道残留物是疏水性的。当分子氧沿这些孔道运动时,分子氧在催化非血红素铁附近进入底物结合口袋。在野生型PA - LOX 中,Ala420侧链显著缩小了O2通道,阻碍了氧向花生四烯酸11R位或亚油酸9R位的扩散。这一结论与该酶的花生四烯酸15S-和亚油酸13S-的脂氧化活性相一致。在Ala420Gly突变体的晶体结构中,我们发现Ala420Gly的取代打开了O2通道的狭窄部分。这样就分叉了单隧道,使得沿此路径行驶的O2分子现在也可以到达花生四烯酸C11或亚油酸C9处的R位置。这一结论解释了突变酶的双重反应特异性, 总之,大气中的双氧可能通过定义的O2通道从PA- LOX的蛋白表面进入催化中心。Ala420Gly交换重定向酶内双氧扩散,导致氧合动力学( 分子氧亲和力的提高 )的改变和脂肪酸氧合反应特异性的改变。
2.选题的目的与意义 得到F557V虚拟突变下脂氧酶的选择性变化及分子层面的原因,完成大豆脂氧酶蛋白质内部定点氨基酸557的虚拟饱和突变,筛选出大豆脂氧酶突变体与底物亚油酸进行分子对接,得到与不同突变体对接之后的结合能的变化等具体数据,了解虚拟突变下脂氧酶的选择性规律。 3.参考文献 [1] 吴桂玲,罗德尉. 脂氧合酶的研究进展[J]. 山东化工,2016,(15):68-69. [2] 敖燕. 分子对接构象搜索优化策略与算法研究[D].成都:电子科技大学,硕士,2014. [3] 沈洁. 发酵灵芝多糖对肝癌细胞的抑制及其与血清蛋白的分子对接模拟[D].无锡:江南大学,博士,2014. [4] 陶佳妮,李赟,姚娣,等. 环糊精与咖啡豆α-半乳糖苷酶的分子对接研究[J].计算机与应用化学.2015(10):1178-1181 [5]CynthiaPalmieri-Thiers, Jean-Christophe Alberti. Identification of putative residuesinvolved in the accessibility of the substrate-binding site of lipoxygenaseby site-directed mutagenesis studies[J].Archives of Biochemistry andBiophysics, 2011, 509: 82–89. [6]BettyJ. Gaffney, Miles D. Bradshaw, Stephen D. Frausto.Locating a Lipid at thePortal to the Lipoxygenase Active Site[J].Biophysical, 2012, 103: 2134–2144. [7]George J.Piazza,Alberto Nufiez.Oxidation of Acylglycerols andPhosphoglycerides by Soybean Lipoxygenase[M].ERRC, ARS, USDA, Philadelphia,Pennsylvania, 19118. [8]PadillaMN , HernándezML,Sanz C,Martínez-RivaselJM .Molecular cloning, functional characterization and transcriptionalregulation of a 9-lipoxygenase gene from olive[J].Phytochemistry, 2011,74(3):58-68. [9] 乔会晶,戴子茹,葛广波,等. 分子对接技术在新药研发领域中的应用进展[J]. 南阳师范学院学报, 2015(12):29-35. [10]Interactionofalpha-cyperonewithhumanserumalbumin:DeterminationofthebindingsitebyusingDiscoveryStudioandviaspectroscopicmethodWang,Q(Wang,Qing)[1];He,JW(He,Jiawei)[1];Wu,D(Wu,Di)[1];Wang,J(Wang,Jing)[1];Yan,J(Yan,Jin)[1];Li,H(Li,Hui)[1] |
2. 研究内容和问题
研究内容:
1.大豆脂氧酶蛋白质内部定点557位氨基酸的虚拟突变,得到一系列对接之后的结合能的变化等具体数据;
2.脂氧酶突变体与亚油酸进行分子对接,分析不同突变体与亚油酸的对接结果;
3. 设计方案和技术路线
本实验采用Discovery Studio2.5软件,对大豆脂氧酶557位突变体与亚油酸进行分子对接,以便得到脂氧酶催化底物选择性反应的规律,更好地理解其催化机理。本实验具体路线为:
1.进行大豆脂氧酶蛋白质内部定点557位氨基酸的虚拟突变;
2.突变之后的大豆脂氧酶突变体与亚油酸进行分子对接,得到对接之后的结合能等具体数据,并用函数打分。
4. 研究的条件和基础
指导老师长期关注课题的研究方向,在理论和实验上提供将充分的辅导。
通过本实验室的前期工作,已建立了DS2.5软件的基本应用分析方法,并对所研究的脂氧酶的酶学性质和催化机理有深入的了解。
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