1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪传染性萎缩性鼻炎（PAR），又称地方性萎缩性鼻炎，是一种慢性接触性呼吸道传染病[1]，属于国家二类动物疫病、世界动物卫生组织规定的B类传染性疾病[2]。产毒素性巴氏杆菌和败血性波氏杆菌是造成本病的主要病原[3]，其中巴氏杆菌毒素（PMT）是引起该病的主要毒力因子，少量PMT即可复制出该病[4]。本病对仔猪危害最严重，主要引起鼻甲骨萎缩、颜面部变形、鼻炎等。虽然猪群患病后死亡率不高，但严重影响进食。患病仔猪生长发育迟缓，饲料转化率低，育肥困难，抵抗力降低、易感染其它疾病[5]。
生猪养殖业属于产业链中游，上游有种植业、饲料、兽药疫苗等，下游是屠宰场和肉制品加工厂等。产业链总产值超过3万亿元，其中养殖业产值达万亿以上。整个链条的每一个环节都尤其的重要[6]，而生猪养殖在中间，它的地位自然是举足轻重的。只有做好猪萎鼻等猪病的防治工作，养殖效益才会得到保障。
本病在养殖场呈散发或地方性流行，一旦出现，容易反复感染，很难净化，疫苗预防是防治的重点[7]。临床上以颈部皮下注射油佐剂二联灭活疫苗[8]为主。近年来，基因工程重组多杀性巴氏杆菌毒素疫苗、壳聚糖微球加载体系疫苗、外膜蛋白重组疫苗、基因工程改建疫苗、重组单体活疫苗等新型萎鼻疫苗也是重点研究方向[9]。本文聚焦疫苗研究中的一个基础技术，猪萎缩性鼻炎攻毒模型的建立。
2. 研究的基本内容和问题
本次实验目的是将使用普通仔猪和南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室提供的支气管败血波氏杆菌、产毒素性巴氏杆菌建立一个良好的动物模型，为后续的疫苗评价实验做好基础。实验内容主要是攻毒菌液的准备、实验动物的筛选、动物攻毒过程、攻毒后观察、模型评价几个方面。实验中关键点是找到建立模型的适宜攻毒浓度区间。最终，建立的模型发病率达到80%，可以称为成功建模。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1 支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的鉴定
1.1菌种复苏及纯度检测
接种环沾取少量AHBb冻干粉于BG平板划线分离细菌，37 ℃温箱培养。24 h后挑取单个菌落革兰氏染色，观察细菌形态，进行纯度鉴定。将鉴定后菌株接种于TSB液体培养基中，200 rpm培养12 h，备用。
接种环沾取少量ZXT Pm冻干粉于TSA平板划线分离细菌，37 ℃温箱培养。24 h后挑取单个菌落革兰氏染色，观察细菌形态。进行纯度鉴定。将鉴定后的菌株接种于BHI液体培养基中，200 rpm培养12 h，备用。
1.2菌种PCR鉴定
分别取出适量AHBb菌液、ZXT Pm菌液，煮沸后得到菌液上清，作为模板，进行支气管败血波氏杆菌PCR鉴定、巴氏杆菌荚膜型及毒力基因toxA的鉴定。
巴氏杆菌参照李福祥等人建立的巴氏杆菌荚膜型鉴定及Liehtensteiger等毒力基因toxA检测方法，波氏杆菌PCR鉴定参照Daniela Hozbora等人建立的方法。设计25 μL的PCR体系：菌液上清1 μL，上下游引物各1μL，2×LA Taq Mix 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL。反应程序为：预变性94 ℃，35个扩增循环为：95 ℃变性10 s；退火温度参照（表1），退火30 s；72 ℃延伸45s；终延伸72 ℃ 10 min。
表1多杀性巴氏杆菌和波氏杆菌鉴定引物
| 名称 | 上引物(5’ to 3’) | 下引物(5’ to 3’) | 产物大小(bp) | 退火温度(℃) |
| Pm | ATCCGCTATTTACCCAGTGG | GCTGTAAACGAACTCGCCAC | 457 | 54 |
| Pm D | TTACAAAAGAAAGACTAGG | CATCTACCCACTCAACCATAT | 647 | 56 |
| toxA | CTTAGATGAGCGACAAGG | GAATGCCACACCTCTATAG | 864 | 56 |
| Bb | AGGCTCCCAAGAGAGAAAG | TGGCGCCTGCCCTATC | 237 | 56 |
1．3培养特性检测
取BHI液体培养基中适量多杀性巴氏杆菌菌液，按1:100接种量接入30 mL新鲜BHI液体培养基中；之后每隔1 h测OD600值，绘制生长曲线；同时对相应时间点进行活菌菌落计数，建立回归方程，绘制出巴氏杆菌在对数期菌落数与OD600之间的关系。
取TSB液体培养基中适量的支气管败血波氏杆菌菌液，按1:100接种量接入30 mLTSB培养基，每隔1h测OD600值，绘制生长曲线；同时对相应时间点进行活菌菌落计数，建立回归方程，绘制出波氏杆菌在对数期菌落数与OD600之间的关系。
测量用于攻毒实验菌液的OD600值，根据回归方程，得到其准确浓度，据此稀释或浓缩至所需浓度。
2攻毒动物的准备
采集准备的实验动物的血液，37℃放置30min，4℃放置2h,分离出血清。一部分血清直接用ELISA试剂盒检测Bb抗体和Pmt抗体，另一部分血清用试剂盒提取DNA进行Bb和Pmt的PCR检测。
2．1抗体的检测
按照Liu, Y文章中ELISA检测方法稍加改进后进行血清中抗体滴度测定，步骤如下：
重组PMT（rPMT）50 ng/孔包被96孔ELISA板，37 ℃孵育2 h后4 ℃过夜；PBST洗板3-5次后加入5%脱脂乳37 ℃封闭3 h；PBST洗板3-5次拍干后加入100 μL事先用PBST稀释好的待检血清（1:40），37 ℃孵育1.5 h；PBST洗板3-5次后分别加入按说明书稀释好的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗鼠IgG，IgG1和IgG2a抗体；孵育45 min后加入TMB显色液，加入2 M硫酸终止反应后在450 nm处读取数值。每份血清重复检测3次。
2．2病原PCR检测
将动物血清沸水煮10分钟，5000rpm离心10分钟得到菌液上清。以此作为PCR模板，采用菌种PCR鉴定中Pm和Bb的相同扩增体系、扩增程序进行PCR鉴定。
只有以上检测均为阴性的猪可以通过筛选，在动物房饲养3天缓解环境应激后，进行下一步的攻毒实验。
3 动物的攻毒及病变评分
共15只相同日龄仔猪，设置3个组别：空白对照组5头，攻毒组2组，每组5头。
攻毒组每头猪鼻孔滴入Bb，一周后，每天攻毒ZXT Pm，连用 4天（剂量见表2）。
表2 实验猪的攻毒剂量
| 组别 | 攻毒Bb含量 | 攻毒ZXT Pm含量 |
| A组：空白对照组 | 无菌PBS | 无菌PBS |
| B组：攻毒组Ⅰ | 每头猪每个鼻孔0.5mL 8.2×106CFU/mL | 每头猪每个鼻孔0.5mL 1×1010CFU/mL |
| C组：攻毒组Ⅱ | 每头猪每个鼻孔0.5mL 8.2×106CFU/mL | 每头猪每个鼻孔0.5mL 1×109CFU/mL |
攻毒实验期间，每天观察并记录猪的咳嗽、流鼻涕、体温、采食情况等症状。分别在攻毒后的7天、14天、21天时观察，猪面部是否变形、是否流鼻涕等症状。在实验第21天时剖杀。检查鼻道内的分泌物的性状及粘膜的变化，如水肿、发炎、出血、腐烂等。沿两侧第一、第二臼齿间的连线锯成横断面，观察鼻甲骨形状和变化,用尺子测量上下鼻甲骨萎缩后所留空隙的长度，并相加求和，按表3进行鼻甲骨病变评级（0级与1级为正常，2级或3级为轻度或中度萎缩性鼻炎，4级或5级为严重萎缩性鼻炎）。
表3萎缩性鼻炎的病变评级
| 病变等级 | 双侧鼻甲骨空洞距离之和/mm |
| 0 | 3~6 |
| 1 | 7~9 |
| 2 | 10~12 |
| 3 | 13~16 |
| 4 | 17~20 |
| 5 | 21 |
技术路线：
可行性分析：
毕业设计提供菌种和技术支持实验室为农业部动物细菌学重点实验室，指导老师长期从事猪病研究，具有丰富经验。实验在南农高科技股份有限公司进行，实验室设备良好，指导实验的相关研究人员认真负责，具有丰富的实验经验，能够保证毕业设计按计划完成。
4. 研究创新点
国外猪传染性萎缩性鼻炎的攻毒模型一般使用的是无菌猪，但本次实验使用的是来自江苏无锡一普通猪场的外三元仔猪。后者优点在于价格更为便宜、取材更方便、饲养条件要求更低，模型更为实惠经济，为进一步进行的疫苗评价等实验做准备。
5. 研究计划与进展
研究计划：
对攻毒使用支气管败血波氏杆菌和掺毒素性巴氏杆菌进行革兰氏染色、PCR鉴定、培养特性鉴定，确定菌种纯度和浓度。对实验用猪抽血进行抗体ELISA检测和病原PCR检测，确定实验动物为阴性，保证实验可靠性。进行实验动物攻毒，观察动物有无鼻炎、发热、咳嗽等疾病症状，在攻毒后第21天全部剖杀，检查实验动物鼻甲骨萎缩情况并进行病变评分。
预期进展：
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