1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是引起猪腹泻的主要病原体，发病猪以呕吐、腹泻、食欲下降和脱水为主要特征，特别是7日以内仔猪感染尤为严重。
1971年，英国最先报道猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）疫情，随后证实其病原体为PEDV21。此后，PEDV在欧洲的许多国及亚洲的日本、韩国、泰国及越南等国家迅速流行。2013年5月美国暴发PED疫情，导致一年内近800万头仔死亡，疫情很快传播到加拿大和墨西哥，当地养猪业损失惨重1。 此后PEDV的流行和进化更趋复杂化，在俄罗斯和意大利北部分别发现了PEDV与猪传染性胃肠炎病毒的重组毒株2。中国各个课题组先后报道了我国存在PEDV重组毒流行。当前，PEDV仍是威胁养猪业健康发展的重要病原之一，防控形势依然严峻3。
PEDV属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，具有与冠状病毒科其它成员相似的病毒粒子形。PEDV基因组核酸类型为线性、单股的正链RNA，全长约28，000nt，5’和3’端分别有帽子结构（cap）和Poly（A）尾。共编码16个非结构蛋白(nsp1-nsp16),4个结构蛋白(S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)及一个辅助蛋白ORF34。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：
本项目利用大肠杆菌表达系统原核表达猪流行性腹泻病毒非结构蛋白，通过western blot等技术对表达的蛋白进行鉴定，然后用蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体，为猪流行性腹泻病毒非结构蛋白的功能研究奠定基础。有望为研发PEDV更加安全有效的疫苗提供思路，从而有利于PEDV的防控。
内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：本项目利用大肠杆菌表达系统原核表达猪流行性腹泻病毒非结构蛋白，通过western blot等技术对表达的蛋白进行鉴定，然后用蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体，为猪流行性腹泻病毒非结构蛋白的功能研究奠定基础。技术路线：引物设计→原核表达载体构建→蛋白表达纯化→western blot鉴定→多克隆抗体制备。实验方案：（1）引物设计：依据猪流行性腹泻病毒全基因组序列，利用序列对比方法找到编码Nsp1的基因，使用软件进行Nsp1基因片段的引物设计，设计一对扩增Nsp1基因的特异性引物，上下游引物两端添加酶切位点。（2）原核表达载体构建:经过PCR扩增Nsp1基因片段，PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。利用胶回收试剂盒对Nsp1基因扩增片段纯化回收，再进行双酶切，同时双酶切载体。酶切结束后电泳切胶回收，两种产物按照适宜比例，利用连接酶在16摄氏度连接过夜。将连接产物通过热击法转化至大肠杆菌感受态细胞，凃布平板。37摄氏度过夜后，挑取单菌落进行PCR鉴定。鉴定阳性的菌落经扩大培养后，用试剂盒提取质粒，送至生物公司测序。（3）蛋白表达纯化：将构建正确的重组质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞。凃布平板。37摄氏度过夜后，分别挑取3至5个单菌落于液体培养基培养12-16小时，以此为种子液。种子液按照1:100转接液体培养基，当菌液的D600值在0.5-0.6时，取1毫升菌液作为诱导前样品，加入IPTG进行诱导表达。诱导6小时后，取1毫升样品作为诱导后样品，将所取样品处理后分析Nsp1表达情况。 小剂量表达验证成功的克隆，扩大培养后进行大量诱导，收集诱导表达菌体后，用PBS缓冲液重悬，超声破碎30分钟，离心收集沉淀。沉淀经尿素溶解后离心取上清。将上清与平衡过的镍柱结合后加入咪唑洗脱杂质蛋白，再洗脱目的蛋白，用酶标仪测定蛋白浓度。（4）western blot鉴定：首先提取细胞蛋白，然后进行SDS-PAGE。取电泳后的凝胶，不经染色，用转印装置将蛋白带电转印到PVDF膜上过夜。将膜置于封闭液中封闭，再平铺入一抗溶液中，洗涤后加入二抗溶液，最后显色，用化学发光成像系统进行图像采集。（5）制备多克隆抗体:Nsp1蛋白适当稀释，采用背部多点皮内注射的方法免疫小鼠。每两周免疫一次，免疫三次。第三次免疫后，小鼠尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA检测血清抗体的效价。可行性分析：本实验室长期从事猪流行性腹泻病毒致病机制研究，从临床病料中分离纯化出多株PEDV流行毒株，且具有开展研究需要的一切仪器设备。非结构蛋白原核表达技术成熟，所需载体等试验材料均已准备好，可保障本试验顺利进行。
4. 研究创新点
本项目通过原核表达猪流行性腹泻病毒非结构蛋白，为猪流行性腹泻病毒非结构蛋白的功能研究奠定基础。有望为研发PEDV更加安全有效的疫苗提供思路，从而有利于PEDV的防控。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2020年1月-2020年3月，查阅文献，设计引物。
2020年4月-2020年5月，原核表达载体构建、蛋白表达纯化以及western blot鉴定。
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