1. 研究目的与意义
内容：
1、融合蛋白3α-HSD的诱导表达和筛选收集；
2、融合蛋白3α-HSD的亲和纯化；
2. 文献综述
3α-羟类固醇脱氢酶的化学修饰机制
李雯
摘 要：3α-羟类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase; 3α-HSD; EC.1.1.1.50），是一种诊断用酶，可以用来测定血清中总胆汁酸（total bile acids, TBA）的浓度，而 TBA 含量是临床上检查肝功能是否异常的常用指标。但由于 3α-HSD 的稳定性差、生产成本高等缺点，限制了其在临床医学中的应用。本实验室前期工作中, 以来源于睾酮丛毛单胞菌 Comamonas testosteroni ATCC11996 的 3α-HSD 基因 hsd A为模板，构建可表达 3α-HSD的基因工程菌（E. coli BL21/p ET28a-hsd），并对其酶学性质进行研究。本论文在此研究基础上，首先利用亲和纯化方法提纯3α-HSD，然后用邻苯二甲酸酐中的羧基与 Lys 残基末端 ε-NH2 生成稳定的酰胺键，有效改善了酶的性能（邻苯二甲酸酐是 Lys 的专一性修饰剂）。最后，按照配方制成TBA试剂盒，在生化分析仪上检测新制成试剂与原试剂各项指标的比较、分析。
3. 设计方案和技术路线
1、融合蛋白3α-HSD的诱导表达和筛选收集；
菌种发酵培养、诱导表达、离心收集细菌沉淀，超声破碎后收取上清液。获得粗酶液。
2、融合蛋白3α-HSD的亲和纯化；
4. 工作计划
1月：查阅文献了解总胆汁酸试剂盒的测试原理、3α-羟类固醇脱氢酶的亲和纯化、化学修饰及生化分析仪的相关知识。
2-3月：将基因重组的3α-羟类固醇脱氢酶进行亲和纯化、化学修饰。
4月：在生化分析仪上分批次检测两种试剂盒。
5. 难点与创新点
运用先进生物技术手段如利用Boyer等人方法测定酶活性、用Bradford法进行蛋白质浓度的测定、酶蛋白的亲和修饰法等。并且运用多种先进仪器如生化分析仪、紫外分光光度计等。成品试剂盒相比于原配方试剂盒相比具有灵敏度高的特点。
阐明3α-羟类固醇脱氢酶的化学修饰方法与机制，为总胆汁酸试剂盒稳定性的研究提供理论依据。
改善3α-HSD酶的酶学性质，对于3α-HSD酶在医药、环保等行业的应用有一定的促进作用。
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